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技術文章

如何提取Insphero 三維(3D)微組織中的RNA?

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很多老師使用瑞士insphero 的3D懸滴培養板獲得3D微組織后,要提取RNA進行熒光定量PCR。下面這篇文章就是介紹如何提取insphero 3D微組織中的RNA:


使用Promega ReliaPrep RNA Tissue Miniprep System提取三維(3D)微組織的RNA


Introduction介紹

基于細胞的藥物開發和毒理學的多項分析,從培養細胞中提取高質量的RNA是非常重要的。一些應用如實時熒光定量PCR或微陣列分析的前提都是需RNA提取步驟。下面介紹的是從很小的微組織(約1000個細胞)中提取總RNA的protocol(ReliaPrep RNA Tissue Miniprep System, promega)。

若想使用自動化RNA提取方法:可使用Promega的Maxwell 16 System。


Summary概述

從3D Insight 人肝臟微組織中提取RNA(ReliaPrep RNA Tissue Miniprep System)。提取的RNA樣本用QuantiFluor RNA system,Agilent 2100 Bioanalyzer,GoTaq 1-Step RT-qPCR System進行分析。


Materials材料

3D Insight Microtissues in GravityTRAP(Insphero)
1×PBS,含鈣離子和鎂離子
ReliaPrep RNA Tissue Miniprep System(Promega Z6110)
Quantus Fluorometer(Promega E6150)
QuantiFluor RNA system(Promega E3310)


Procedure操作流程


一、微組織的準備


1.輕柔的吸除GraityTRAP板中的培養基,用70ul的1×PBS洗滌微組織2次,如下圖Figure 1:

Figure 1: Pipette tip positioning during aspiration and addition of PBS


注:輕柔、緩慢洗滌微組織(<30ul/秒)


2.轉移微組織,1000ul吸頭垂直覆蓋GraityTRAP板孔的底端,吸頭要與孔底部緊密接觸,如Figure 2,將微組織吸出(約50ul)轉移到1.5ml離心管中,避免吸入氣泡(避免微組織損失)。

Figure 2: Microtissue harvest from GravityTRAP plate using a 1000ul pipette tip


3. 4000g離心1min,去除PBS,直接作為RNA提取的樣本


二、RNA提取—ReliaPrep RNA Tissue Miniprep System

1.直接加250ul LBA+TG buffer到樣本中

2.漩渦震蕩10秒,用吸頭吹打10次,裂解微組織。如想更完全裂解,可使用掌上均質器5-10秒

3.再加85ul的isopropanol(異丙醇),漩渦震蕩5秒混合均勻

4.再參照ReliaPrep RNA Tissue Miniprep System的手冊進行結合和洗脫等步驟

5.用30ul水洗提RNA后,冰上放置

6.RNA濃度和產量用QuantiFluor RNA system和Quantus Fluorometer檢測


Typical Results結果

使用ReliaPrep RNA Tissue Miniprep System提取3D InSight人肝臟微組織中的RNA,結果見Figure 3.

Figure 3:A-RNAs were isolated from either 1,2,4,or 8 microtissues. Yields were determined using the QuantiFluor RNA system with the Quantus Fluorometer and the RNA 6000 Pico kit. All values are greater than 9 indicating high quality RNA. 

B-HPRT specific primers were used with the GoTaq 1-Step RT-qPCR System to show amplifiability of the isolated RNAs.

C-RNAs were isolated from single microtissues to compare the average yield from one microtissue using this purification system.The line represents the average yield(n=6).


原文章鏈接:

http://www.qbioscience。。com/FileUPLoad/DownLoadFile/635659149543906250.pdf

Insphero 三維細胞培養產品鏈接:

http://www.qbioscience。。com/products_T304.html


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