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技術文章

nightsea熒光適配器觀測綠色熒光時濾光片的選擇

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觀察GFP和包括FITC在內的綠色熒光,都可以使用nightsea的體視顯微鏡熒光適配器(Stereo Microscope Fluorescence Adapter),這毫無問題。我們經常遇到的問題是:是用下圖中黃色的longpass濾光片好呢?還是選擇綠色的bandpass濾光片好。


答案是:不能一概而論,常要視具體情況來做出選擇。下文分析一下兩者各自的優缺點。

  Longpass:可以透過任何超過~500nm波長的光

  Bandpass:透光波長以~530nm為中心,透光波長范圍約~60nm。

就是說bandpass只能透過綠色光,而longpass可以透過的光包括了綠,黃,橙和紅色。


濾光片有何作用?

濾光片就是用來強化預觀察的熒光信號的:它能擋住(源于激發光源的)反射光,同時透過我們想觀察的熒光信號。在實際觀察中常常受到來自觀測區域內其它潛在熒光信號的干擾(噪音),這類背景熒光信號可能來自培養基(線蟲研究中常會有此問題),或是其它東西(例如植物葉綠素和發育中的斑馬魚的yolk發出的熒光信號)。


Longpass和bandpass在阻擋激發光上都沒有問題。問題焦點是面對這些噪音信號,兩者中哪個才是正確的選項?


如果背景信號和你要觀察的信號在波長上不存在重疊,那應該選擇bandpass濾光片。如下圖所示,擬南芥(或其它植物)的葉綠素發出紅色熒光,其波長峰值約為685 nm,bandpass可以將它過濾掉,這樣就可以輕松觀察GFP信號而不再受到它的干擾(*張顯示longpass濾光片下存在信號疊加,第二張bandpass下只余下綠色熒光)。

 

擬南芥圖片由波士頓大學John Celenza博士惠贈。

更多圖片鏈接:http://www.nightsea。。com/articles/green-bandpass/


但是,在所要觀察的熒光信號與背景信號波長存在交叉疊加時,將背景信號過濾掉則可能引起問題。這時,使用longpass濾光片保留背景信號更好:可以通過信號的強度和顏色的對比來區分(哪是要觀察的熒光信號,哪是背景信號)。下面是一條轉熒光基因的斑馬魚圖片。這條斑馬魚在心臟表達GFP,在血細胞表達mCherry。Longpass(上端)就可以將此區分出來,而bandpass(下端)就不能。上端圖像可以呈現出清晰的綠色熒光心臟,紅色熒光血細胞,還有yolk天然發出的黃色熒光。而在選擇bandpass濾光片所獲的圖像里,滿眼是強弱不等的綠色,這些綠色并不全是來自GFP的表達,因此容易造成混亂和誤判。

斑馬魚圖片由Williams大學Martha Marvin博士惠贈,該轉基因斑馬魚由Buffalo大學Lara Hutson博士雜交培育。


有的情況下,則兩種濾光片都可以。線蟲培基可以呈現綠色熒光背景,同樣是面對這一場景,有的觀測人員傾向使用bandpass,有的傾向用longpass,前者認為bandpass比longpass增加了一些清晰度和對比度??傊?,面對此種情景,個人偏好在zui終選擇上起了關鍵作用。


如果是探索自然界的熒光信號,那沒有疑問,應該選擇longpass。選擇bandpass的話,你可拍不出下圖藿香薊花的美妙來!



該文英文由Nightsea提供

http://www.nightsea。。com/sfa-sharing/longpass-vs-bandpass-barrier/

該文由群曉科苑翻譯,群曉科苑為nightsea授權代理商。

發現絢爛熒光,體會多彩自然,可登陸nightsea圖庫:http://www.nightsea。。com/galleries/

nightsea熒光適配器產品介紹:http://www.qbioscience。。com/productShow_538.html

更多nightsea熒光產品介紹,請參考:http://www.qbioscience。。com/Brand_T28.html


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