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技術文章

cellendes 3D細胞水凝膠系統使用操作步驟

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德國cellendes的3D細胞水凝膠系統是一套用于3D細胞培養時構建細胞外基質組分的試劑。使用者可以利用這些試劑控制細胞外環境,設計適合細胞生存的3D系統。

3D細胞水凝膠系統與活體細胞外基質相似,采用該系統可使體外細胞培養更接近體內的生理特征,是基礎研究、藥物篩選和再生醫學等領域細胞功能研究的理想選擇。



一、使用cellendes 3D細胞水凝膠系統時的注意事項:


1. 所有步驟均在無菌環境下操作。
2. 一般選擇使用10x CBpH 5.5,10x CBpH 5.5不適合時,才會使用10x CBpH 7.2 。但是使用10x CBpH 7.2時,凝膠形成的速度很快,降低CB的pH值,可以減緩凝膠形成的速度,可以混合10x CBpH 5.5和10x CBpH 7.2 。



CBpH 5.5和CBpH 7.2混合后CB的pH值(詳見說明書p10)


3. 細胞懸液: PBS或培養基懸液
4.  Mal-PVA或Mal-Dextran溶解后冰浴上使用。溶解后應放于-80℃保存,使用時避免反復凍融,如果短期內使用,可以4℃放置(1周左右)
5. PEG-link和CD-link不要長時間暴露在空氣中



二、使用cellendes 3D細胞水凝膠系統時實驗前準備:


1. 解凍、溶解3D水凝膠組分(詳見說明書),保證全部溶解
2. 如果3D水凝膠需添加RGD肽(詳見說明書):
A. 用水溶解RGD肽,使終濃度是3.0mmol/L
B. 如需比較RGD肽不同濃度的效果,會使用硫代甘油,需將硫代甘油:水=1:6.7溶解,使終濃度是3.0mmol/L
3. 保證Mal-PVA或Mal-Dextran 冰浴上
4. 準備細胞懸液(PBS或培養液),建議細胞懸液濃度時2-4 x106/ml,使zui終濃度時10000-20000個細胞/30ul



三、無RGD肽時cellendes 3D細胞水凝膠系統實驗操作:


注:需保證馬來酰亞胺基團(Mal- )和硫醇基團(SH- )等量
可以預實驗決定凝膠強度

注:CBpH5.5和細胞懸液的量是不變的,為了保證等滲條件


實驗步驟如下:


A.按上表混合水、CBpH5.5、Mal-PVA(或Mal-Dextran)、細胞懸液于一管(管1)中
B.將PEG-link(或CD-link)滴加到培養皿表面
C. 用吸頭吸出管1中的組分,與培養皿上的PEG-link(或CD-link)混合,快速吹打3-4次
D. 避免產生氣泡,放置至少一分鐘(3-5min),等待凝膠形成
E. 一旦凝膠形成,輕輕加培養液至覆蓋住凝膠,蓋上培養皿蓋,至合適的溫度孵育
F. 兩個小時后更換新培養基



四、用RGD肽時cellendes 3D細胞水凝膠系統實驗操作:


一般情況下1mmol/l或低于1mmol/l的RGD肽,就可以提供足夠的粘附力
當需比較RGD肽濃度以及是否需要使用RGD肽時,需用到硫代甘油
下表中列舉的是:馬來酰亞胺基團(Mal--)=硫醇基團(SH--)=5mmol/l,選擇zui合適RGD肽濃度時,需用硫代甘油來調節


 如確定交聯強度是5mmol/l,可按下表預實驗RGD肽濃度



實驗步驟如下:


                     實驗操作示意圖(30ul體系)


A. 按上表混合水、CBpH5.5、Mal-PVA(或Mal-Dextran)、細胞懸液于一管(管1)中
B. 添加RGD肽和硫代甘油于管1中,快速混勻,室溫放置5-10min,有足夠的時間使RGD peptide共價結合到馬來酰亞胺基團(Mal- )上
C. 將PEG-link(或CD-link)滴加到培養皿表面
D. 將細胞懸液添加到管1中
E. 用吸頭吸出管1中的組分,與培養皿上的PEG-link(或CD-link)混合,快速吹打3-4次
F. 避免產生氣泡,放置至少一分鐘(3-5min),等待凝膠形成
G. 一旦凝膠形成,輕輕加培養液至覆蓋住凝膠,蓋上培養皿蓋,至合適的溫度孵育
H. 兩個小時后更換新培養基



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