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技術文章

ELISA實驗常見問題及解決方案

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  為什么所有試劑和檢測樣本要平衡至室溫后再進行加樣操作?
  溫度是ELISA結合反應的重要影響因素。為了使所有樣本在一致的溫度下反應,實驗前務必將所有試劑平衡至室溫,包括檢測樣本。避免因溫度的動力學反應差異而導致ELISA檢測結果的不準確。
  如何獲得良好線性的標準曲線?
  按照推薦方式保存標準品;溶解標準品之前需短暫離心,徹底收集粉末;確保標準品完全溶解和混勻(大約10min),然后再進行后續的系列稀釋步驟,確保每一步都充分混勻且移液;顯色的恰當終止;選擇合適的數學擬合方程繪制標準曲線。
  ELISA實驗為什么必須設置復孔?
  為獲得更準確的實驗結果,強烈建議標準品及樣本進行復孔檢測。
  因為復孔檢測可以:
  ★計算平均值,確保實驗結果更準確;
  ★解決實驗中誤操作造成的跳孔現象;
  ★計算CV值,對實驗的操作和試劑盒的精密度進行評估。
  為什么實驗過程中孵育、洗滌需要振蕩?如何振蕩?
  振蕩孵育使反應更充分,振蕩洗滌使背景更干凈。建議使用酶標96孔微孔板振蕩器。
  孵育過程振蕩,可以加快、加強抗原抗體分子間的相互碰撞接觸,使得反應過程更加完全,OD值通常會比未振蕩孵育的結果要高;洗滌過程振蕩,可以使洗板更干凈,在很大程度上能降低背景值,同時可以提高試劑盒檢測的靈敏度。
  何時終止ELISA反應?
  ELISA實驗zui終需要酶催化底物顯色反應來完成,在*時間終止反應是ELISA實驗成功的重要因素。在HRP-TMB酶促反應系統中,當zui高濃度標準品顏色不再變深,倒數2-3個濃度標準品顏色開始有淺藍色時,便需要終止反應;或者也可以根據zui高濃度標準品孔在620nm的OD值來決定,OD620=0.9-0.95之間時即可終止。
  為什么酶標儀讀數時必須選用雙波長?
  首先,酶標儀使用前務必預熱10-15min,使測讀結果更穩定。其次,ELISA實驗采用雙波長測定吸光度,可以排除單波長檢測時的測定干擾(標本的濃度,干擾色等)。一般采用zui大波長作為參照波長,在參照波長下,檢測物的吸光值zui小,檢測波長和參照波長的吸光值之差可以消除非特異性吸收;因此,雙波長測定,可zui大限度的消除指紋、雜質及不透光的物質對酶標儀讀數帶來的誤差,以保證實驗數據的準確度。
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