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單克隆抗體的克隆化方法有哪些?

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   克隆的時間一般說來越早越好。因為在這個時期各種雜交瘤細胞同時旺盛生長,互相爭奪營養和空間,而產生抗體的細胞有被淹沒和淘汰的可能。但克隆時間也不宜太早,太早細胞性狀不穩定,數量少也易丟失。
  克隆化的陽性雜交瘤細胞,經過一段時期培養之后,也還會因為細胞突變或特定染色體的丟失,使部分細胞喪失產生抗體的能力,所以需要再次或多次克隆化培養??寺』螖档亩嗌儆煞置谀芰娙鹾涂乖拿庖咝詮娙醵鴽Q定。一般說,免疫性強的抗原克隆次數可少一些,但至少要3~5次克隆才能穩定。
  克隆化的方法很多,包括有軟瓊脂克隆化、顯微操作法、熒光激活分離法及限稀釋法等。
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  借助撒在軟瓊脂上單個細胞定位生長,而達到克隆化,具體操作如下:
  1.配2.5%的瓊脂糖30ml,水浴溶化后,移入45℃水浴中。
  2.將117ml完全DMEM液和3ml 10倍濃度的DMEM液混合,置45℃水浴預熱。
  3.將瓊脂糖與DMEM液混合,即為含0.5%瓊脂糖的完全DMEM液,并加75×108 脾細胞。
  4.每塊平皿加10ml,于室溫中凝固。
  5.DMEM中的細胞與DMEM—瓊脂1:1混合,將細胞瓊脂混合物2ml鋪于凝固的平板上,使其全部覆蓋。
  6.放入CO2箱飽和濕度,37℃培養10天。
  7.用PBS配制0.6%瓊脂糖,于沸水浴溶解后,置45℃,在保溫情況下取一試管,迅速加入0.1ml 25%羊紅血球,0.2ml豚鼠補體,2.7ml 0.6%瓊脂糖。
  8.用3ml瓊脂糖—羊紅血球混合液覆蓋克隆。于37℃CO2箱孵育1h~2h。從克隆上部溶解羊紅血球的溶血范圍,可篩選抗羊紅血球Ig。
 ?。ǘ╋@微鏡操作法
  在直徑6cm培養皿中,加入1ml 1.0×108細胞懸液放置5%CO2飽和濕度,37℃溫箱中放置30min以上,倒置顯微鏡下,尋找那些與周圍相距甚遠的單個細胞,將毛細管口(一頭有直角彎頭毛細管,一頭連接一尺長乳膠管,用口控制液體進入)水平置放于液面上,左右微動,直到看見管口,對準細胞,吸入毛細管,將管中細胞移到預先加有2.0×104~5.0×104飼養細胞96孔板內,培養后,即可獲得單個細胞形成的克隆。
 ?。ㄈ晒饧せ罘蛛x法
  用一種熒光激活細胞分類器(Fluorescein Activafed Cell Sorter,FACS)。其基本原理是:將細胞經熒光抗體染色后,經噴嘴形成單個細胞的線形液滴,在萊塞光激發下,熒光素發射熒光,此信號由光電倍增管接收,再結合細胞形態大小產生光散射信號,經電腦處理,產生信號并與預定的信號對比,根據細胞熒光強度及細胞大小不同,將細胞分成不同級別,在電場中發生偏離,而分別收集于不同容器中。
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  1.材料
 ?。?)微量培養盤,盤內各孔于克隆化前一天培養小鼠腹腔細胞(即飼養細胞)每孔2萬~4萬。
 ?。?)HT培養基
  2.操作方法
 ?。?)取出抗體陽性孔細胞,用HT培養液制成細胞懸液。并取樣進行臺盼蘭染色,計數。
 ?。?)用HT培養液將細胞稀釋成200個/ml、40個/ml、20個/ml和的懸液。
 ?。?)用吸管將細胞懸液分別種入微量培養盤,每孔0.05ml,細胞含量分別為10個/孔、2個/孔、1個/孔和0.5個/孔。
 ?。?)5%CO2飽和濕度,37℃培養。
 ?。?)每天用倒置顯微鏡觀察克隆生長情況,選擇只有一個集落生長的孔,棄掉兩個以上和沒有細胞生長的孔。
 ?。?)克隆大量繁殖后,布滿孔底的1/3~1/2時,測培養液抗體。
 ?。?)抗體陽性孔細胞,移到有飼養層的組織培養瓶中,并傳2~4代就可以脫離飼養細胞,建成克隆株。
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